|
Аннотация:
|
Тиолпероксидазы представляют cобой ферменты, катализирующие восстановление неограни-ческих (H2O2) и органических гидропероксидов, и включают в себя глутатионпероксидазы (Gpx) и пероксиредоксины. Тиолпероксидазы группы Gpx утилизируют глутатион (GSH) в качестве восста-новителя. Ранее установлено, что внеклеточная селензависимая глутатионпероксидаза (Gpx3), выде-ленная из плазмы человека, обладает широкой субстратной специфичностью по отношению к тиолам и может утилизировать такие низкомолекулярные тиолы как цистеин, меркаптоэтанол и дитиотреитол вместо GSH (Takebe et al. J. Biol. Chem. 2002. 277: 41254-41258). В предыдущих исследованиях нами получены результаты, свидетельствующие в пользу того, что Gpx3 плазмы крови крыс способна утилизировать восстановленную форму гомоцистеина (Hcy-SH) вместо восстановленного GSH в тиолпероксидазной реакции с H2O2 (Разыграев и др., Биомед. химия, 2016, 62: 431-438). В настоящей работе, выполненной с использованием Hcy-SH, мы заменили H2O2 трет-бутилгидропероксидом (TBHP) и разработали новый вариант метода определения тиолперокси-дазной активности в сыворотке крови с применением реактива Эллмана для регистрации убыли тиола. При использовании реакционной смеси, состоящей из 0.073 M Tris-HCl буфера (pH 8.5), 0.25 мM ЭДTA, 17.1 мM NaN3, 0.45 мM DL-Hcy-SH, 1.6 мM TBHP и разбавленной сыворотки крови крыс (температура инкубации смеси – 37 °C), показано, что скорость реакции Hcy-SH с TBHP, катализируемой ферментом сыворотки, пропорциональна содержанию биоматериала в реакционной смеси; скорость ферментативной реакции постоянна в течение более чем 40 с инкубации. Мольное отношение между Hcy-SH и TBHP в катализируемой реакции близко к 2:1, что соответствует стехиометрии Hcy-SH:TBHP–оксидоредуктазной реакции. В кинетическом исследовании установлено, что концентрация TBHP, равная 1.6 мМ, является насыщающей для фермента при 0.45 мM DL-Hcy-SH. Мы полагаем, что Hcy-SH и TBHP – оптимальное сочетание субстратов для определения тиолпероксидазной активности в сыворотке (или активности Gpx3) по причине низкой скорости спонтанного взаимодействия Hcy-SH с TBHP в используемых условиях инкубации.
|
